Validierungsaspekte zur Bestimmung der Partikelgrößenverteilung per Laserbeugung
1.1 Validierungsaspekte
Je nach Produkt und Phase sind die verschiedenen Validierungsaspekte in unterschiedlicher Breite bzw. Detailtiefe zu betrachten.
Der Umfang der Robustheitsprüfung ist demnach abhängig von der klinischen Entwicklungsphase:
| Klinischen Entwicklungsphase | Mindestumfang der Robustheitsprüfung |
| 1 | • Geräteparameter (Steuer- und Auswerte-Parameter) |
| 2 | • Geräteparameter (Steuer- und Auswerte-Parameter)
• Probenvorbereitungsparameter |
| 3 | • Geräteparameter (Steuer- und Auswerte-Parameter)
• Probenvorbereitungsparameter • Substanzeigenschaften |
Steht während einer Validierung die Untersuchung der Robustheit und der Präzision an, dann sollte die Robustheit untersucht werden, bevor die Präzision evaluiert wird.
1.1.1 Spezifität / Selektivität
Im Sinne der ICH Q2 (R1) nicht anwendbar.
In der Regel ist eine Differenzierung der Partikel etwa nach Substanzen über die Laserbeugungsmethode nicht möglich. Auch die Unterscheidung zwischen Luftblasen und vorhandenen Partikeln ist nicht einfach sicherzustellen.
1.1.2 Richtigkeit
Der Messbereich ist durch die angewendete Technik und den Gerätetyp gegeben (vergl. ISO 13320). Die prinzipielle „Richtigkeit“ der gemessenen bzw. berechneten Größenklassifizierungen wird im Rahmen der Geräte(re)qualifizierungen und Funktionsüberprüfungen bzw. Kalibrierungen und über den Systemeignungstest anhand von Messungen zertifizierter Referenzmaterialien nachgewiesen. Ein zusätzlicher, produktspezifischer Nachweis dieses Validierungsaspektes ist nicht erforderlich.
1.1.3 Robustheit
Grundlegende Robustheitsuntersuchungen (Ermittlung relevanter Einflussfaktoren etc. über einen breiten Bereich, evtl. über DoE „Screening Design“) sollten im Idealfall während einer Methodenentwicklungsphase bereits durchgeführt worden sein.
Liegen systematische Untersuchungen bzw. Erkenntnisse aus der Methodenentwicklung bzgl. der relevanten Einflussparameter vor, ist die Durchführung des einfachen Testumfangs hinreichend. Fehlen solche Erkenntnisse, sollte der erweiterte Testumfang durchgeführt werden.
In der Validierung brauchen nur die relevanten Einflussparameter bzw. -faktoren betrachtet zu werden. Hier soll belegt werden, dass kleine Variationen relevanter Parameter keinen relevanten Einfluss auf die zu berichtenden Messergebnisse (Zielgrößen) haben. Um dies zu belegen, kann auch ein DoE-Versuchsansatz statt dem hier beschriebenen verwendet werden (präferiert: „Robustness“ über ein „fractional factorial“-Design mit Pseudo-Resolution“ ≥ 3 oder ein „Placket-Burman“-Design auf Basis eines linearen Modells bzw. eines mit „Interactions“).
Für die Testung der Robustheit wird eine Probe daher unter verschiedenen, veränderten Bedingungen gemessen.
Relevante Einfluss-Faktoren sind in der Regel die Messung steuernde Geräteparameter („Run Length“, „Wait Time“, „Stirrer Speed“, „Number of Runs“), Probenvorbereitungsparameter (Dauer der Ultraschallbehandlung, „Obscuration“ der vermessenen Dispersion, weitere Faktoren zur Herstellung der Vordisperierung) und Eigenschaften der verwendeten Substanzen (Charge des Dispergiermittels, Charge des Probenmaterials).
Relevante Zielgrößen sind in der Regel d10, d50 („median“), d90 und gegebenenfalls „mean“, „mode“, sowie berechnete Größen wie RSD von d10, d50 und d90. Ist die Angabe weiterer Zielgrößen (d.h. zu berichtende Ergebnisgrößen) in der Analysenvorschrift gefordert, werden diese ebenfalls ermittelt und entsprechend ausgewertet.
Sollte die Mie-Theorie zur Auswertung der Messdaten herangezogen werden, müssen entsprechend weitere Einfluss-Faktoren bei der Robustheitsuntersuchung betrachtet werden (Variation des Brechungsindex des Dispergiermittels und real und imaginärer Teil des Brechungsindex der Probe).
Für jede der Testungen werden zuerst die unterschiedlichen Läufe (Runs) überlagert und verglichen, um relevante Änderung in der Partikelgrößenverteilung im Verlauf der zusammengehörigen Messungen entdecken zu können:
- das regelmäßige Absinken der % Volumenverteilung deutet auf eine Sedimentierung der Suspension oder auf ein Lösen der Partikel in dem Dispergiermittel hin
- der Anstieg der % Volumenverteilung dagegen auf eine nicht stabilisierte Suspension
- das Ansteigen der % Volumen im höheren Partikelbereich deutet auf eine Agglomeratbildung hin
- während der Anstieg der % Volumenverteilung im unteren Partikelbereich auf die Sedimentierung der großen Partikel oder ein Zermahlen hindeutet.
- das Ansteigen der Obscuration deutet auf ein Zermahlen der Partikel oder auf eine nicht hinreichend stabilisierte Suspension hin
- das Absinken der Obscuration deutet auf Sedimentation oder Auflösung der Partikel hin.
Akzeptanzkriterien für Robustheits-Parameter [1]:
Die Methode ist geeignet, wenn folgende Kriterien erfüllt sind:
| Für Partikelgrößen des Messbereichs ≥ 10 µm (n=6) | Für Partikelgrößen des Messbereichs < 10 µm (n=6) | |
| d50: | RSD ≤ 10 % | RSD ≤ 20 % |
| d10, d90: | RSD ≤ 15 %. | RSD ≤ 30 %. |
Für Ergebnisse mit einer „Run Number“ anders als 6 sind die Grenzwerte entsprechend anzupassen.
1.1.3.1 Messdauer („Run Length“):
Die Dauer bestimmt, ob während der Messungen hinreichend viele, repräsentative Daten erfasst werden können (z.B. auch für die Partikel mit größerem Volumen).
Für schmale Partikelgrößenverteilungen bzw. kleine Partikelgrößen kann eine relativ kurze Messdauer hinreichend sein, für polydisperse Partikelgrößenverteilungen oder gröbere Partikel kann eine längere Messdauer erforderlich sein.
1.1.3.1.1 Erweiterter Testumfang „Run Length“
Je 6 Wiederholungsmessungen (Runs) einer Probensuspension sollen mit einer eingestellten Messdauern von 5 s, 10 s, 30 s bzw. 60 s (und ggf. 90 s) gemessen werden, d.h.: pro Messdauer wird eine Suspension mit 6 „Runs“ gemessen (Wait Time etc. gemäß Analysenvorschrift; ggf. zusätzlich auch mit Wait Time = 0) .
Mit der in der Analysenvorschrift angegeben „Run Length“-Einstellung sollte ebenfalls gemessen werden. Zudem sollte mindestens eine „Run Length“-Einstellung länger und mindestens eine kürzer sein als die in der Analysenvorschrift angegebene. Diese sollten wenigstens 10% größer bzw. kleiner sein.
Für jede Messdauer wird neben dem Mittelwert für d10, d50 und d90 auch die relative Standardabweichung pro Messdauer und Ergebnisparameter berechnet. Ausserdem erfolgt eine graphische Auswertung. Einzelwerte, Mittelwerte und RSD für d10, d50 und d90 für jede Messdauer (y-Achse) werden gegen die Messdauer (X-Achse) aufgetragen.
1.1.3.1.2 Einfacher Testumfang „Run Length“
Eine Probensuspension soll zunächst mit der „Run Length“-Einstellung gemäß der Methodenvorschrift, dann mit einer um mindestens 10% längeren und mit einer um mindestens 10% kürzeren „Run Length“ vermessen werden (mit je 6 „Runs“).
1.1.3.1.3 Bewertung „Run Length“
Jede relevante Änderung in der Partikelgrößenverteilung soll im Bericht kommentiert werden.
Eine geeignete Messdauer entspricht dem Akzeptanzkriterium für die RSD bzgl. d10, d50 und d90 (s.o.; RSD berechnet über alle Runs einer Messdauer).
1.1.3.2 Stabilität der Suspension: Einfluss der „Wait Time“
Finden Agglomerat-Bildung oder Deagglomeration, Auflösung oder Sedimentierung in relevantem Ausmaß während der Messung statt, so können die Ergebnisse verfälscht werden und liefern keine repräsentative Aussage über die Partikelgrößenverteilung des zu vermessenden Materials.
1.1.3.2.1 Erweiterter Testumfang „Wait Time“
Je eine Probensuspension soll mit 6 „Runs“ nach unterschiedlichen „Wait Time“-Einstellungen mit der vorgeschriebenen Messdauer vermessen werden: 0 s, 60 s, 180 s, 300 s.
Mit der in der Analysenvorschrift angegeben „Wait Time“-Einstellung sollte ebenfalls gemessen werden. Zudem sollte mindestens eine „Wait Time“-Einstellung länger und mindestens eine kürzer sein als die in der Analysenvorschrift angegebene. Diese sollte wenigstens 10% größer bzw. kleiner sein.
Für jede „Wait Time“ wird neben dem Mittelwert für d10, d50 und d90 auch die relative Standardabweichung pro „Wait Time“ und Ergebnisparameter berechnet. Ausserdem erfolgt eine graphische Auswertung. Einzelwerte, Mittelwerte und RSD für d10, d50 und d90 für jede „Wait Time“ (Y-Achse) werden gegen die „Wait Time“ (X-Achse) aufgetragen.
1.1.3.2.2 Einfacher Testumfang „Wait Time“
Eine Probensuspension soll zunächst mit der „Wait Time“-Einstellung gemäß der Methodenvorschrift, dann mit einer um mindestens 10% längeren und mit einer um mindestens 10% kürzeren „Wait Time“ vermessen werden (mit je 6 „Runs“).
1.1.3.2.3 Bewertung „Wait Time“
Jede relevante Änderung in der Partikelgrößenverteilung soll im Bericht kommentiert werden.
Eine geeignete „Wait Time“ entspricht dem Akzeptanzkriterium für die RSD bzgl. d10, d50 und d90 (s.o.; RSD berechnet über alle Runs einer „Wait Time“).
1.1.3.3 Stabilität der Suspension: Rührgeschwindigkeit
Die gewählte Rührgeschwindigkeit soll dafür sorgen, dass die Probe während der Messung hinreichend suspendiert bleibt, ohne dass z.B. gleichzeitig Luftblasenbildung verursacht wird oder die vorhandenen Partikel zermalen werden.
1.1.3.3.1 Erweiterter Testumfang Rührgeschwindigkeit
Je eine Probensuspension soll mit je 6 Runs gemäß der Analysenvorschrift mit unterschiedlich eingestellten Rührgeschwindigkeiten gemessen werden.
Gemessen wird mit den Rührgeschwindigkeitseinstellungen 10%, 40%, 70% und 100%.
Mit der in der Analysenvorschrift angegeben Rührgeschwindigkeitseinstellung sollte ebenfalls gemessen werden. Zudem sollte mindestens eine Einstellung höher und mindestens eine niedriger sein als die in der Analysenvorschrift angegebene. Diese sollte wenigstens 10% größer bzw. kleiner sein.
Für jede Rührgeschwindigkeit wird neben dem Mittelwert für d10, d50 und d90 auch die relative Standardabweichung pro Rührgeschwindigkeitseinstellung und Ergebnisparameter berechnet. Außerdem erfolgt eine graphische Auswertung. Einzelwerte, Mittelwerte und RSD für d10, d50 und d90 für jede Rührgeschwindigkeit (Y-Achse) werden gegen die Rührgeschwindigkeitseinstellung (X-Achse) aufgetragen.
1.1.3.3.2 Einfacher Testumfang Rührgeschwindigkeit
Eine Probensuspension soll zunächst mit der Rührgeschwindigkeitseinstellung gemäß der Analysenvorschrift, dann mit einer um mindestens 10% höheren und mit einer um mindestens 10% niedrigeren Einstellung vermessen werden (mit je 6 „Runs“).
1.1.3.3.3 Bewertung Rührgeschwindigkeit
Jede relevante Änderung in der Partikelgrößenverteilung soll im Bericht kommentiert werden.
Eine geeignete Rührgeschwindigkeit entspricht dem Akzeptanzkriterium für die RSD bzgl. d10, d50 und d90 (s.o.; RSD berechnet über alle Runs einer Rührgeschwindigkeit).
1.1.3.4 Stabilität der Suspension: Anzahl der Läufe („Runs“)
Die Anzahl der Läufe verlängert quasi die Messdauer pro Suspension.
Die Läufe der Versuche zur „Wait Time“ können ausgewertet werden. Dabei reicht die Betrachtung der „Runs“ der in der Methode vorgeschriebenen „Wait Time“, sofern diese sich als geeignet erwiesen hat.
Dazu werden die Einzelwerte für d10, d50 und d90 für jeden „Run“ (Y-Achse) graphisch gegen die „Run Number“ (X-Achse) aufgetragen und die relativen Volumenverteilungen (% relative volume) der Messungen verglichen. Für eine geeignete Anzahl „Runs“ sollten diese sich nicht nennenswert verändern, z.B. erhöhen oder verringern. Die Abweichung der relativen Volumenverteilung am Maximalwert sollte zwischen zwei nacheinander gelaufenen Testläufen max. 20 % und zwischen dem ersten und dem letzten Testlauf max. 30 % betragen.
Des Weiteren wird überprüft, ob die „Obscuration“ während der Messungen gesunken oder gestiegen ist und ob sie sich im geeigneten Bereich (s.o.) befindet. Die Abweichung der „Obscuration“ sollte zwischen zwei nacheinander gelaufenen Testläufen max. 20 % betragen.
Eine Veränderung des relativen Volumens und / oder der „Obscuration“ kann zum Beispiel auf eine Sedimentation, Agglomeratbildung, Auflösung oder Zerstörung (Zermahlen) der Partikel hindeuten.
1.1.3.5 Probendispersionsverfahren
Mit Hilfe eines Mikroskops soll ein visueller Vergleich des Probenpulvers vor der Dispersion mit dem dispergierten Pulver (Probensuspension) durchgeführt werden.
Dies dient einer Abschätzung des Größenbereiches und der Form der Partikel des Probenmaterials (vergl. auch Ph.Eur. 2.9.37).
Ferner soll so überprüft werden, ob die Partikel adäquat dispergiert wurden.
Der Vergleich der Mikroskop-Bilder erfolgt sowohl für Dispersionen, die per Ultraschallbehandlung als auch für anderweitig mechanisch hergestellte Dispersionen (z.B. per Vortex-Mixer).
1.1.3.5.1 Variation der Dispersionsenergie am Beispiel Ultraschallbehandlungsdauer
Die verwendete Dispersionsenergie soll die Partikelgrößenverteilung möglichst nicht nennenswert durch irreversible Veränderungen des Probenmaterials (z.B. durch Zerkleinerung der Partikel) verfälschen.
1.1.3.5.1.1 Erweiterter Testumfang Ultraschallbehandlungdauer
Aliquote einer Probenvorbereitung (Vordispergierung) werden nach unterschiedlichen Ultraschallbehandlungsdauern (1, 3, 5, 10 min mit gleicher Ultraschall-Intensität) vermessen (je 6 „Runs“).
Mit der in der Analysenvorschrift angegeben Ultraschallbehandlungsdauer sollte ebenfalls gemessen werden. Zudem sollte mindestens eine Ultraschallbehandlungsdauer länger und mindestens eine kürzer sein als die in der Analysenvorschrift angegebene. Diese sollte wenigstens um 30 s größer bzw. kleiner sein.
Für jede unterschiedliche Dauer der Ultraschallbehandlung wird neben dem Mittelwert für d10, d50 und d90 auch die relative Standardabweichung pro Dauer und Ergebnisparameter berechnet. Ausserdem erfolgt eine graphische Auswertung. Einzelwerte, Mittelwerte und RSD für d10, d50 und d90 für jede Dauer (Y-Achse) werden gegen die Dauer der Ultraschallbehandlung (X-Achse) aufgetragen.
1.1.3.5.1.2 Einfacher Testumfang Ultraschallbehandlungsdauer
Aliquote einer Probenvorbereitung (Vordispergierung) werden nach unterschiedlichen Ultraschallbehandlungsdauern (gemäß Methodenanweisung, einmal mind. 30 s länger und einmal mind. 30 s kürzer mit gleicher Ultraschall-Intensität) vermessen (je 6 „Runs“).
Für jede unterschiedliche Dauer der Ultraschallbehandlung wird neben dem Mittelwert für d10, d50 und d90 auch die relative Standardabweichung pro Dauer und Ergebnisparameter berechnet. Ausserdem erfolgt eine graphische Auswertung. Einzelwerte, Mittelwerte und RSD für d10, d50 und d90 für jede Dauer (Y-Achse) werden gegen die Dauer der Ultraschallbehandlung (X-Achse) aufgetragen.
1.1.3.5.1.3 Bewertung Ultraschallbehandlungsdauer
Jede relevante Änderung in der Partikelgrößenverteilung soll im Bericht kommentiert werden.
Eine geeignete Dauer der Ultraschallbehandlung entspricht dem Akzeptanzkriterium für die RSD bzgl. d10, d50 und d90 (s.o.; RSD berechnet über alle Runs einer Ultraschalldauer).
1.1.3.6 Dispergiermittel-Chargen
Bestimmung einer Probensuspension gemäß der Analysenvorschrift, aber mit mindestens 2 unterschiedlichen Chargen Dispergiermittel (z.B.. Sonnenblumenkernöl) und je mit 6 „Runs“.
1.1.3.6.1 Bewertung Variation Dispergiermittel-Chargen
Jede relevante Änderung in der Partikelgrößenverteilung soll im Bericht kommentiert werden.
Ein geeignetes Dispergiermittel entspricht dem Akzeptanzkriterium für die RSD bzgl. d10, d50 und d90 (s.o.; RSD berechnet über alle Runs einer Charge) für jede Charge.
1.1.3.7 Proben-Chargen
Bestimmung einer Probensuspension gemäß der Analysenvorschrift für mindestens 2 unterschiedliche Probenmaterial-Chargen, aber mit je 6 „Runs“.
Die hierzu verwendeten Chargen müssen repräsentativ und sollten zudem gleichartig sein. Das heißt, dass alle nach demselben, festgelegten Verfahren hergestellt worden sein müssen, da sich Herstellverfahrensänderungen auch auf für die Messung relevante Festkörpereigenschaften negativ auswirken können. Auch wenn sich die Partikelgrößenverteilungen der Chargen stark unterscheiden (z.B. unterschiedliche Siebfraktionen), ist die Methode unter Umständen nicht für beide Fälle geeignet.
1.1.3.7.1 Bewertung Variation Proben-Chargen
Das Ergebnis jeder Charge entspricht dem Akzeptanzkriterium für die RSD bzgl. d10, d50 und d90 (s.o.; RSD berechnet über alle Runs einer Charge).
1.1.3.8 Linearität / Obscuration
Die Untersuchung einer Linearität im Sinne der ICH Q2 ist hier nicht sinnvoll anwendbar.
Dennoch ist zu untersuchen, in welchem Bereich der „Obscuration“ Messungen durchgeführt werden können.
Zu hohe Konzentrationen führen zu Mehrfach-Beugungen und verfälschen die Ergebnisse. Zu niedrige Konzentrationen verschlechtern das Signal/Rausch-Verhältnis und damit auch die Präzision der Ergebnisse oder lassen gar keine Ergebnisberechnung mehr zu.
Die optimale „Obscuration“ ist auch von der Partikelgrößenverteilung abhängig: kleinere Partikel benötigen eher geringere „Obscuration“-Werte.
1.1.3.8.1 Erweiterter Testumfang „Obscuration“
Suspensionen der Probe sind bei 6 unterschiedlichen „Obscuration“-Werten im Bereich von etwa 5 bis 30 zu messen (je Messung: 6 „Runs“). Der Bereich sollte möglichst gleichmäßig abgedeckt sein; Beispiel: bei 5, 8, 10, 15, 20, 25 und 30.
Die so erhaltenen Werte für d10, d50, d90 (Y-Achse) werden graphisch gegen die „Obscuration“ (X-Achse) auftragen.
1.1.3.8.2 Einfacher Testumfang „Obscuration“
Suspensionen mit Obscuration-Werten in der Mitte, am oberen Rand und am unteren Rand des laut Methodenvorschrift erlaubten Bereiches werden gemessen (mit je 6 „Runs“).
1.1.3.8.3 Bewertung „Obscuration“
Jede relevante Änderung in der Partikelgrößenverteilung soll im Bericht kommentiert werden.
Eine akzeptable „Obscuration“ entspricht dem Akzeptanzkriterium für die RSD bzgl. d10, d50 und d90 (s.u.; RSD berechnet über alle Runs einer „Obscuration“).
1.1.4 Bereich
Im Sinne der ICH Q2(R1) nicht anwendbar.
Der Messbereich liegt laut Herstellerangaben zwischen 0.04 und 2000 µm. Das Fraunhofer-Modell kann laut „NIST recomended practice guide“ effektiv nur für Partikel > 1 µm angewendet werden, d.h. Partikelgrößenverteilungen mit Partikelgrößenverteilungen außerhalb dieses Bereiches können nicht vollständig allein durch dieses Messverfahren aussagekräftig bestimmt werden. Der anwendbare Bereich bgl. der „Obscuration“ wird im Rahmen des Abschnittes „Linearität / Obscuration“ ermittelt.
1.1.5 Präzision
Um die Präzision der Messung (bzw. die Wiederholbarkeit und die interne Vergleichspräzision) zu testen, werden folgende Versuche durchzuführen:
| Aufnahme der folgenden Histogramme und Ermittlung der Ergebnisse:
|
|||||||||||||
| Wiederholbarkeit
|
· eine 6-fach Einzelbestimmung (d.h. 6 x 1 Probenvorbereitung bzw. Vordispergierung) gemäß der probenspezifischen Vorschrift. | ||||||||||||
| Interne Vergleichspräzision | · Eine vollständige Bestimmung einer Probe gemäß der probenspezifischen Vorschrift[2] durchgeführt von mindestens 3 unterschiedlichen Personen an jeweils 2 unterschiedlichen Tagen:
mit X = 1 vollständige Analyse der selben Proben-Charge |
||||||||||||
Akzeptanzkriterien für Präzision [3]:
Die Methode ist geeignet, wenn folgende Kriterien erfüllt sind:
| Für Partikelgrößen des Messbereichs ≥10 µm | Für Partikelgrößen des Messbereichs < 10 µm | |
| d50: | RSD ≤ 10 % | RSD ≤ 20 % |
| d10, d90: | RSD ≤ 15 %. | RSD ≤ 30 %. |
(RSD berechnet über alle gültigen „Runs“ eines Analysendurchgangs; d.h. für Wiederholbarkeit berechnet über 6 „Runs“, bei interner Vergleichspräzision berechnet über 9 „Runs“.)
Für Ergebnisse mit einer davon abweichenden „Run Number“ sind die Grenzwerte entsprechend anzupassen.
2 Querverweise
- Eur. 6.6, 2.9.31., „PARTICLE SIZE ANALYSIS BY LASER LIGHT DIFFRACTION“
- USP 32 – NF 27, <429>, „LIGHT DIFFRACTION MEASUREMENT OF PARTICLE SIZE“
- ISO Standard 13320-1 (1999)
- FDA Draft Guidance „Analytical Procedures and Methods Validation“ (August 2000)
- ICH Q2(R1), “VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURES: TEXT AND METHOLOGY” (Nov 2005)
- „Design of Experiments, Principles and Applications“, 3rd, MKS Umetrics AB (2008) (ISBN-10: 91-973730-4-4)
- “PQRI Recommendations on Particle-Size Analysis of Drug Substances Used in Oral Dosage Forms”, S.M. Snorek et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 96, No. 6, 1451 – 1467 (2007)
[1] Die hier angegebenen Werte sind Richtwerte. Sie sind von dem gemessenen Produkt abhängig und können je nach Produktspezifität/-charakteristik, Messanforderung und Messaufwand (z.B. Anzahl der Bestimmungen und gemessener Runs) angepasst werden. Ist laut Analysenvorschrift die Ausgabe anderer Zielgrößen erforderlich, sind dafür ebenfallls Akzeptanzkriterien in diesem Sinne festzulegen. Für DoE-Untersuchungen sind andere Akzeptanzkriterien festzulegen (z.B.: kein getesteter Einflussfaktor hat einen signifikant negativen Einfluss auf die betrachteten Zielgrößen; Voraussetzung: das angewendete statistische Modell ist hinreichend (R2-Q2 < 0.3, Q2 > 0.5, model validity > 0.25, model reproducibility > 0.5)).
[2] meist 3 individuelle Probenvorbereitungen mit je 3 „Runs“ (d.h. insgesamt 9 „Runs“); der genaue Wert ist der produktspezifischen Vorschrift zu entnehmen.
[3] Die hier angegebenen Werte sind Richtwerte. Sie sind von dem gemessenen Produkt abhängig und können je nach Produktspezifität/-charakteristik, Messanforderung und Messaufwand (z.B. Anzahl der Bestimmungen und gemessener Runs) angepasst werden
Bericht zur Entwicklung analytischer Methoden
1. Ziel und Anforderungen
In diesem Abschnitt soll die Aufgabenstellung erläutert werden.
Die von der zu entwickelnden Methode zu erreichenden Leistungen und Eigenschaften sollten in diesem Abschnitt definiert und begründet werden. Was (Identität, Reinheit, Gehalt,…) soll durch die Methode wovon (Rohstoff, Intermediat, Wirkstoff, Hilfsstoff, Formulierung,…) ermittelt werden? Worauf kommt es besonders an? Wie präzise müssen die Ergebnisse sein und ist es erforderlich die Richtigkeit zu betrachten? Was wäre warum noch akzeptabel? In welchem Arbeitsbereich muss die Methode anwendbar sein und welche unterschiedlichen Probematerialien (Matrix) sollen vermessen werden können?
Annahmen, Voraussetzungen und Randbedingungen (inkl. Qualität, Kosten, Zeit, Kundenwünsche,…) sollten ebenfalls mit aufgeführt werden.
2. Allgemeine Methodenbeschreibung
Analytisches Prinzip
Eine kurze Rationale, warum das ausgewählte analytische Prinzip anderen möglichen Alternativen vorgezogen wurde, sollte in diesem Abschnitt dargelegt werden: Warum wurde z.B. eine konventionelle HPLC (RP18, 5μm Partikelgröße) gewählt und einer UPLC-Trennung oder einer Kapillarelektrophorese vorgezogen?
Was ist der Grund für die gewählte Wellenlänge?…
Soweit vorhanden sollte hier auch auf die entsprechenden allgemeinen Methoden der Arzneibücher (Ph.Eur., USP, …) Bezug genommen werden; evtl. kann auch ein Verweis auf entsprechende ISO-Normen oder ASTM-Methoden oder Ähnliches hilfreich sein.
Ein Prozessablaufdiagramm (Fließschema) zur Beschreibung des Analysenablaufes könnte ebenfalls hilfreich sein.
Instrumente
Welche Geräte welcher Hersteller wurden zur Entwicklung verwendet? Gibt oder gab es besondere Anforderungen an die Geräte?
Reagenzien
Welche Reagenzien und Standards welcher Hersteller wurden zur Entwicklung verwendet? Gibt oder gabe es besondere Anforderungen (z.B. bzgl. der Qualität) an die Chemikalien bzw. Zubereitungen?
3. Selektivität und „gestresste“ Proben
Sofern dieser Parameter in der Methode eine Rolle spielt (d.h. jedenfalls in jeder Trennmethode), sollten hier die Versuche und Ergebnisse zur Optimierung der Trennung beschrieben, diskutiert und interpretiert werden.
Versuche können z.B. mit „gestressten“ Proben (mögl. realistischer Anteil an Zersetzung) oder mit extra hergestellten Mischungen aus Hauptkomponente(n) und Verunreinigungen bzw. Matrixkomponenten (Hilfsstoffen) durchgeführt werden.
4. Robustheit
Gemäß der ICH Guideline zur Methodenvalidierung ist die grobe Evaluierung der Steuer- und Störgrößen (Einflußparameter bzw. -größen) auf relevante Zielgrößen (Messgrößen, z.B. Auflösung) eine Aufgabe, die in der Methodenentwicklungsphase bearbeitet werden sollte. Unter Umständen bereits (literatur)bekannte Parameter stehen hier im Fokus.
– (siehe auch DoE oder multivariate Datenanalyse oder Regelkarten)
5. SST-Rationale
Aus dem Prinzip der analytischen Methode und den untersuchten Robustheitsparametern kann eine Rationale für die „System Suitability Test“ Parameter entwickelt werden. Akzeptanzgrenzen könnten z.B. mit Hilfe von Auswertungen zur Methodenfähigkeit bzw. über Cp / Cpk-Betrachtungen unter Berücksichtigung der Anforderungen an die Methode (siehe 1.) begründet festgelegt werden.
Zur strukturierten Dokumentation und Ableitung bzw. Einordnung der Wichtigkeit der Parameter kann unter Anderem auch die Risikoanalyse herangezogen werden (FMEA, FTA).
6. Abschätzung der Messunsicherheit
Aus dem Prozess zur Durchführung der Analyse und einer strukturierten Abschätzung der Beitrage der unterschiedlichen potentiellen Fehlerquellen (z.B. „Ursache-Wirkungs-“ oder „Fischgrätendiagramm“) kann die Messunsicherheit abgeschätzt und/oder aus Experimenten hergeleitet werden. Die Messunsicherheit der Methode kann in Relation zu den Anforderungen (Spezifikationen) gesetzt auch hier diskutiert werden.
7. Abschließende Bewertung
Hier sollen zusammenfassend die erreichten Eigenschaften der entwickelten Methode den Anforderungen gegenübergestellt und bewertet werden. Erfüllt die Methode in jeder Hinsicht die Zielstellung oder sind einige Aspekte weniger gut erfüllbar? Was kann die Methode nicht? Ist die Methodenentwicklung abgeschlossen und erscheint die Methode validierbar?
Zur Validierung analytischer Methoden siehe auch „Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics, Guidance for Industry“, CDER / CBER, July 2015.
Rationale für Phasenkonzept zur Validierung analytischer Methoden
(Vorüberlegungen / Risikoanalyse)
Voraussetzungen:
Methoden konnten entwickelt werden (Kriterien für Abschluss der Methodenentwicklung?)
In der “Robustness” zur Validierung wird nur demonstriert, dass kein zu großer Effekt bei kleinen Einflussfaktorveränderungen vorliegt; gem. ICH gilt: “considered robustness during development”; “SST-parameters to maintain validity of analytical procedure developed on basis of robustness testing” (z.B. über DoE, Screening Design)
Annahmen:
Proben des Untersuchungsmaterials bei Methodenentwicklung waren repräsentativ und homogen.
Änderung in der Synthese oder in der Zusammensetzung eine „Drug Product“ haben Auswirkungen auf den Validierung. Unter gegebenen Umständen werden die betroffenen Aspekte für das veränderte, zu analysierende Produkt wiederholt, sofern sie nicht ohne nennenswerten Einfluss auf die Qualität der Analysenergebnisse sind.
Bei Änderungen im Analysenprozess gilt analog: betroffene Aspekte werden erneut untersucht, sofern nicht ohne
zusätzliche Versuche plausibel argumentiert werden kann, warum die Änderungen kein nennenswerter Einfluss auf die
Analysenergebnisse vorhanden ist.
Aspekte in der Reihenfolge der Wichtigkeit:
1. Selektivität
Sofern Nachweis Selektivität erforderlich ist oder nicht – wie bei spezifischen Methoden – vorausgesetz werden kann: wichtigster Parameter, der bei jeder Methode als erstes demonstriert werden sollte.
Ohne Selektivität ist keine reproduzierbare Analytik möglich, da die erhaltenen Werte nur Summenwerte sind, bei denen der Anteil der zu bestimmenden Substanz unbekannt ist. Zudem ist auch der Nachweis der Identität einer Substanz nicht zweifelsfrei möglich.
2. Präzison
Wiederholbarkeit
Die Wiederholbarkeit einer Bestimmungsmethode (Messunsicherheit) sollte bekannt sein, sobald Effekte von Änderungen der Herstellungsbedinungen oder Änderungen während der Lagerungen damit beobachtet werden sollen. Die Anforderungen an die Messunsicherheit ist dabei davon abhängig, wie klein die Effektunterschiede sind, die noch unterscheidbar sein sollen (siehe auch Signifikanzniveau).
In dieser Phase ist noch nicht so wichtig, ob die erhaltenen Werte richtig sind, sondern nur, ob sie relativ zueinander höher oder niedriger (besser oder schlechter) werden. Konstant systematische Abweichungen („offset“) können – falls erforderlich – auch noch im Nachhinein mit verrechnet werden, so dass die Verwendung der Daten auch für spätere Zeitpunkte gewährleistet ist. Mögliche vorhandene Fehler in der Sensitivität (Steigung) führen zu einer Überhöhung oder Verringerung bei der Interpretation des Einflusses von Einflussparametern. Auch hier ist eine erneute korrigierende
Datenverrechnung der gemessenen Werte bei Bedarf zu einem späteren Zeitpunkt möglich und die Daten müssen dann nicht notwendigerweise neu erhoben werden.
a) Wiederholbarkeit im Zentrum des Messbereiches (100% Level)
b) Wiederholbarkeit am oberen und unteren Rand des Messbereiches
c) intermediäre Präzision (in gewisser Weise verwand mit Robustheit; ist Basis für die Möglichkeit der Beurteilung von Werten z.B. von Stabilitätsuntersuchungen)
3. Linearität
Risiko: mögliche kleinere Verfälschung der Ergebnisse im Messbereiches, die nicht bei der Wiederholbarkeit b) gezeigt wurde.
4. Richtigkeit
(z.B. über Wiederfindung)
Risiko: systematischer Fehler (bias), um den die ermittelten von den konventionell „wahren“ Werten abweichen (evtl. auf Grund von Matrix-Effekten). Sofern über die Linearität auch gezeigt wurde, dass der Achsenabschnitt nicht nennenswert verschieden vom Nullpunkt ist, ist das Risiko gering.
5. LOD/LOQ
Risiko (wenn „Wiederholbarkeit b)“ kein Problem): gering.
6. Robustheit
Ausmaß der Änderungen von Einflussgrößen auf die Zielgrößen (Output): Untersuchung z.B. über DoE statt über „one factor at a time“
Zur Validierung analytischer Methoden siehe auch „Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics, Guidance for Industry“, CDER / CBER, July 2015.
Carsten – Kommentar zur analytischen Methode „Essigsäure in synthetischen Peptiden“ (2.5.34., Ph.Eur. 4.0)
Essigsäure in synthetischen Peptiden
Die Methode beschreibt eine Quantifizierung von Essigsäure in synthetischen Peptiden mittels Flüssigchromatorgraphie (LC)I. Sie ersetzt die zuvor in den entsprechenden Monographien beschriebenen, oft untereinander eng verwandten gaschromatographischen Methoden wie etwa im Falle von GonadorelinII, Somatostatin oder Protirelin.
Die neu etablierte HPLC-Methode zeigt eine bessere Präzision als die zuvor beschriebenen GC-Methoden. Sie stellt eine Anpassung einer bereits vorhandenen Methode zur Bestimmung von Acetat in Zelluloseacetat-butyratIII dar. In der Ph.Eur. Monographie für Gonadorelinacetat des Supplement 2000 wurde bereits eine sehr ähnliche Reverse-Phase (RP) Flüssigchromatorgraphiemethode publiziert.
Mobile Phase:
Bei den bereits erwähnten und miteinander verwandten LC-Methoden basiert die Retention des Analyten generell auf der Wechselwirkung zwischen der hydrophoben stationären Phase (Octadecylsilicagel) mit den in der mobilen Phasen wandernden EssigsäuremolekülenIV. Der pH-Wert der mobilen Phase ist bei 3,0 gepuffert. Dies ist signifikant unter dem pKa der Essigsäure (4,76V). Die Hydrophobizität der organischen Säure wird also durch die Protonierung der Carboxylat-Gruppe gesteigert, wodurch sich die Retentionszeit im Vergleich zum deprotonierten Molekül verlängert.
Im Gegensatz zu der oben erwähnten, für Gonadorelinacetat beschrieben Methode, verwendet die unter 2.5.34. aufgeführte Methode nur für die ersten 5 min einen isochratischen Modus. Danach beginnt eine Gradientenelution (Steigerung des organischen Lösungsmittelanteils in der mobilen Phase), wodurch hydrophobere Komponenten von der Säule gewaschen werden sollen.
In vielen Fällen ist dies sicher ein unverzichtbarer Schritt. Würde er nicht durchgeführt, so würden die Peptidmoleküle an der stationären Phase adsorbiert bleiben und sich auf der Säule akkumulieren. Die Folge wäre eine signifikante Beeinflussung der chromatographischen Charakteristika des Systems und damit eine Verschlechterung der Reproduzierbarkeit der Chromatographie.
Obwohl dieser zusätzliche Reinigungsschritt eine Verbesserung zu der „früheren Version“ dieser Methode darstellt, so ist vermutlich immernoch nicht garantiert, dass auch extrem hydrophobe Peptide durch die 50%ige Methanollösung ebenfalls vollständig entfernt werden. Da die Methode jedoch als eine allgemein anwendbare Methode zur Analyse des Essigsäuregehaltes in Peptiden dargestellt wird, sollte der Anwender sich dieses potentiellen Problems bewusst sein. Dies gilt vor allem, wenn die Methode für Peptide angewendet werden soll, bei denen sie nicht in einer aktuell gültigen Ph. Eur. Monographie explizit vorgeschrieben ist.
Eine höhere Methanolkonzentration für den Reinigungsschritt könnte möglicherweise in einigen speziellen Anwendungsfällen notwendig sein. Alternative zur Verwendung Methanol bietet sich unter anderem auch Acetonitril an, da es eine höhere Elutionskraft als Methanol besitzt und somit für Reinigungszwecke dieser Art unter Umständen besser geeignet erscheint. Eine generelle Substitution von Methanol durch Acetonitril in allen verwendeten mobilen Phasen würde sich ohne eine entsprechende Anpassung des Gradientenprogrammes vermutlich jedoch nicht unbedingt vorteilhaft auswirken: die Verringerung des Retentionsfaktors für das Essigsäuresignal wäre die Folge.
Stationäre Phase:
Auf der anderen Seite stellen vermutlich sehr basische Peptide ein weiteres Problem für die Lebenszeiterwartung der Säule dar, zumal die in der Methodenbeschreibung erwähnte stationäre Phase nicht „endcapped“ ist. Sehr basische Substanzen könnten daher aufgrund von elektrostatischen Wechselwirkungen an den noch verbliebenen, negativ geladenen freien Silanolgruppen des gepackten Materials haften bleiben.
Sowohl sehr hydrophile Peptide als auch andere verwandte Moleküle, die möglicherweise in der zu analysierenden Substanzprobe ebenfalls enthalten sein könnten (wie z.B. Trifluoracetat, Formiat, etc.), überlagern das Essigsäuresignal unter Umständen ganz oder teilweise. Aus diesem Grund sollte das chromatographische Auflösungsvermögen und die Selektivität des Analysensystems immer beobachtet werden und auf jede gewünschte Anwendung abgestimmt sein. Unglücklicherweise ist die Retentionszeit des Essigsäuresignals mit 3 bis 4 min bemerkenswert kurz.
Ein größere Retentionsfaktor für den Analyten bedeutet meist eine verbesserte Auflösung in der chromatogrophischen TrennungVI. Um gute Trennergebnisse zu erhalten sollten die Werte für die relevante Retentionsfaktoren üblicherweise im Bereich von 2 bis 10 liegen.
Möglicherweise führt die Verwendung von speziellem, für die Analyse von stark polaren organischen Säuren besonders geeignetem C18-Säulenmaterial („polar encapped“) zu einer Verlägerung der Retentionszeit des Analyten und somit zu einer besseren Auflösung. Zusätzlich würde „polar endcapping“ vor dem als „hydrophober Kollaps“ bekannten Effekt schützen. Dieser Effekt kann bei herkömmlichen Octadecyl-Säulen beobachtet werden, sobald sie mit wässrigen Eluenten mit nicht mehr als 5% organischen Lösungsmittelanteil betrieben werdenVII.
Weitere Chromatographiebedingungen und Systemeignungstest:
Die Temperatur beeinflusst ebenfalls die Auflösung von RP-HPLC-Trennungen. Dies triff besonders bei der Trennungen von ionischen Analyten zu. Obwohl eine Kontrolle der Säulentemperatur gemäß der Ph.Eur. Methodenbeschreibung nicht vorgeschrieben ist, so erscheint dies für die praktische Routinearbeit dennoch empfehlenswert.
Begründet durch all diese Einzelfaktoren erscheint es ebenso empfehlenswert einen Systemeignungstest bei der Anwendung durchzuführen. Die Trennsystemtauglichkeit kann so beurteilt werden, bevor die zu analysierenden Proben laufen. Eine Trennnug von eng verwandten Molekülen wie etwa Formiat, Lactat, Citrat, Propionat, Trifluoracetat und Acetat und eine anschließende Prüfung der Auflösungsfaktoren könnte hier hilfreiche Dienste leisten.
Alternative Trennmethoden:
Sofern die Methodenbeschreibung nicht uneingeschränkt übernommen werden soll oder muss, können zur Bestimmung des Essigsäuregehaltes in Peptiden ganz allgemein statt der vorliegenden Ph.Eur. HPLC-Methode auch andere Methoden ausgewählt werden. Daher hier noch eine kurzer Blick auf die sich bietenden Alternativen:
Ein vom Chromatographieprinzip her anderer Ansatz wird in der „Gonadorelin Hydrochlorid“ Monographie der 24 – NF19 Supplement 2 im Test „limit of acetate“ beschrieben. In diesem Fall wird eine Anionenaustauschersäule (quartäres Ammin, chemische gebunden an spherische Silica Kernpartikel) in Kombination mit einer schwefelsäurehaltigen, wässrigen mobilen Phase verwendet.
Eine weitere Alternative wäre die Anwendung der klassischen Ionenchromatographie (IC), die in solchen Fällen meist mit Anionenautauscherharzen auf Basis von organischen Polymeren in Verbindung mit wässrigen Natronlauge- oder Carbonatlösungen als Eluenten betrieben wird.
Ganz allgemein kann zur Bestimmung von Acetat in Peptiden auch die hydrophile Interaktionschromatographie, die Ionenpaarchromatographie, die Ionenexklusionschromatographie, die Kapillaryelectrophoresis (CE) sogar die Isotachophorese (ITP) herangezoen werden. In diesem Zusammenhang erscheinen die CE VIII, die Ionenexklusionschromatographie oder die IC die wertvollsten Alternativen zur Trennung an der reversen Phase zu sein.
Detektion und mögliche Alternativen:
Beide oben erwähnten Pharmakopoe-HPLC-Methoden (die der USP und die der PhEur) verwenden die direkte UV-Absorption bei einer recht kurzen Wellenlänge als Detektionsmethode. Die meisten kommerziell erhältlichen HPLC-Systeme werden vermutlich mit einem UV-Detektor zusammen ausgeliefert, zumal die UV-Detektion vermutlich die am häufigsten verwendete Detektionsmethode ist. Die Detektion mit Hilfe eines Brechungsindexmonitors beispielsweise wäre für eine isochratische Methode durchaus anwendbar, erscheint jedoch meist anspruchsvoller in der Handhabung und ist im Allgemeinen für Gradientenmethoden eher ungeeignet. Für die IC und die CE ist die Detektion mittels unterdrückter Leitfähigkeitsmessung durchaus üblich. Leitfähigkeitsdetektion kann vermutlich die Sensitivität im Vergleich zur UV-Detektion erhöhen. Sie führt aber ebenfalls zu einer weniger selektiven Detektion, da hiermit auch anorganische Anionen quasi „eingeblendet“ werden. Zudem scheint eine mangelnde Sensitivität der UV-Detektion in den meisten Fällen nicht das Problem zu sein. Die Detektion per UV-Absorption erscheint demnach also in den meisten Fällen die erste Wahl zu sein.
Kalibrierung:
Die Ph.Eur. Methode 2.5.34. beschreibt eine quantitative HPLC-Analyse auf Basis einer 1-Punkt-Kalibrierung. Hierbei wird eine Lösung von Eisessig in Wasser als Referenzlösung verwendet. Die oben erwähnte USP-Methode beschreibt statt dessen die Herstellung einer Lösung von Natriumacetat-trihydrat in Wasser zur Verwendung als Referenzlösung. Vom Standpunkt des Anwenders her erscheinen beide Möglichkeiten qualitativ gleichwertig zu sein. Es kann jedoch empfehlenswert sein den Gehalt des verwendeten Referenzmaterials auf einen entsprechenden international anerkannten Referenzstandard zurückführen zu können, obwohl dies weder von der USP noch von der Ph. Eur. gefordert wird.
Präzision:
Unglücklicherweise erwähnen allgemeine Ph.Eur. Methoden nie, wie viele Proben für eine Bestimmung vermessen werden sollten und wie oft (z.B.: Einzel-, Doppel- oder Trippelinjektion) jede Einzelprobe evaluiert werden sollte. Das Maß der Messunsicherheit der Ergebnisse ist demnach durch die Methodenbeschreibung nicht definiert und die Erstellung eines geeigneten Analysenprogramms ist damit vollständig dem Anwender überlassen. Sinnvollerweise sollte die Messunsicherheit der Analysenergebnisse natürlich mit der geforderten Spezifikation abgestimmt sein. In diesem Zusammenhang kann eine Betrachtung der Methodenfähigkeit gute Dienste leistenIX.
I siehe auch Ph.Eur. 2.2.29
II siehe auch 2.2.28 und Ph. Eur. Monographie für Gonadorelinacetat im Supplement 1999.
III siehe auch Ph.Eur. Monographie für Celluloseacetate-butyrate.
IV siehe auch Lloyd R. Snyder et al., „Parctical HPLC Method Development“, 2nd Edition, John Wiley & Sons, 1997;
oder J.H. Knox and B Kauer, „High Performance Liquid Chromatography“, R.A. Hartwick Eds., John Wiley & Sons, 1989.
V D.R. Lide Ed., „CRC Handbook of Chemistry and Physics, 80th Edition“, CRC Press LLC, 1999.
VI J.W. Dolan,“Starting Out Right, Part III – The Role of the Solvent in Controlling Selectivity“, LCGC 18(2), 118, 2000.
VII R.D. Morrison,J.W. Dolan, „Reversed-Phase LC in 100% Water“, LCGC, 13(10), 720, 2000.
VIII K.D. Altria, „Capillary Electrophoresis in the Pharmaceutical Industry“, Pharmeuropa 10(4), 524, 1998.
IX S. Kromidas;”Validierung in der Analytik”, Wiley/VCH, 2000.
Publikation: „Selective Modification of Unprotected Peptides in Water“
„Selective Modification of Unprotected Peptides in Water“
H.Dibowski, C.Gittel, Ch.Seitz und F.P.Schmidtchen
Proceedings of the 7th Akabori Conference, Hrsgr. H.Kunz, Universität Mainz, Heidelberg, 1998, S.5-9; ISBN 3-00-003357-2
(Carsten: „Habe selber leider keine Kopie davon.“)
Carstens Poster für NATO Workshop in Johnstown 1995
Poster präsentiert auf dem „NATO Advanced Research Workshop on Bioorganic Catalysis“ (17. – 21. Mai 1995, University of Pittsburgh, Johnstown, Pensylvania, U.S.A.)
Nähere Infos zur Veranstaltung siehe „Molecular Design and Bioorganic Catalysis“, Craig S. Wilcox and Andrew D. Hamilton, Ed., Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, 1996 (ISBN 0-7923-4024-8).









